王师正在借助电脑观察实验中贝壳的壳内细胞分布情况红领金服。 杨琪琪
在动物骨骼造血研究领域取得突破性发现，在国际上首次证实无脊椎动物骨骼中普遍存在造血干细胞巢——
一次“失误”揭开无脊椎动物的“生命密码”
在大众的固有认知中，贝壳不过是贝类用来保护自身的“石头外壳”，是毫无生命的碳酸钙矿物质，事实果真如此吗？
近日，中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室、方宗熙海洋生物进化与发育研究中心包振民院士和王师教授团队在国际权威学术期刊《科学进展》发表的最新研究成果，在国际上首次揭示了无脊椎动物骨骼中普遍存在造血干细胞巢，颠覆了骨骼造血为脊椎动物特有的传统观念，为理解动物骨骼造血系统的起源和演化提供了全新视角。
贝壳里可能存在活细胞
该项研究成果题为“无脊椎动物骨骼中普遍存在‘类骨髓’造血干细胞巢”。“这个发现源于一次实验中的‘意外发现’。”海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室、方宗熙海洋生物进化与发育研究中心王师教授回忆道。传统观念认为，贝壳是由外套膜，即贝类边缘的特殊组织分泌形成的。尽管很早学术界就已发现贝壳里能够检测到DNA核酸分子，但通常认为这是源自外套膜细胞在分泌矿化物质时，死掉的细胞被包裹进贝壳里而形成的残留“遗迹”。2017年红领金服，团队在用常规软体组织核酸提取方法处理新鲜贝壳的过程中，遇到了反常的问题：样本不仅能够检测到DNA，还意外发现活细胞的指示物―RNA的存在。
“按照生物学常识，RNA极不稳定，在活细胞外会快速降解，而贝壳一贯被认为是‘无生命’的矿化物，本不该有RNA残留。”王师说，团队最初怀疑是贝壳内表面的软体组织未清理干净导致样本污染，但在彻底清理后，仍能检测到RNA的存在。这一发现让团队意识到，贝壳里可能存在活细胞。“这意味着我们过去认为的‘无生命的石头’―贝壳，其实是一个活的器官，这是最根本的观念颠覆。”
这个“意外”，成为突破传统认知的第一道裂缝。然而，要证明贝壳里有活细胞，首先需要“眼见为实”。为此，团队花了近半年时间，尝试去除贝壳表面坚硬的碳酸钙层，暴露内部的有机质层，“可以把贝壳想象成牙齿，我们要做的就是把外面坚硬的牙釉质去除，看到里面的牙髓。”该研究主要完成人连姗姗副教授介绍，这项工作成功后，团队又开始反复优化染色和固定方法，便于在显微镜下观察细胞的分布。“一开始染色效果非常不理想，因此我们做了很多尝试，最终选择了‘边脱钙边固定’的方式，尽可能保持细胞的完整形态。”最终，该团队成功脱除了贝壳的部分钙质层，并通过染色清晰地观察到了细胞的存在和分布，证实了贝壳里确实存在具有活性的细胞。
王师（右一）为团队成员讲解贝壳的生长特性。 杨琪琪 摄
贝壳内的造血干细胞比例高达40%-60%
这些存活于贝壳中的细胞属于何种类型、有着什么样功能？如何揭开这层谜团，成为团队后续研究中亟待攻克的又一关键难题。
“前期我们检测到的贝壳RNA，通过比较转录组分析提示其具有类似干细胞特征，但我们不确定具体有多少干细胞、是否存在其他细胞。单细胞测序技术的发展给了我们很大帮助，也提出了更大的挑战。”连姗姗告诉记者，该实验的核心难点在于，之前观察细胞形态，只需要保持细胞结构完整，但单细胞测序技术通常要求对活细胞进行分析。仅解决这一问题就耗费了团队近一年时间。“后来我们摸索出了相对直接的方法：一是分析贝壳内偏好表达的胶原类型；二是短时间内将贝壳物理破碎成小块，这样能显著加快脱钙速度。但破碎后，脱钙产生的有机膜片非常细小，需要大量人力一片片地手工挑取出来。挑出来后，再通过物理方法，如研磨、酶解等，将细胞从膜片中释放出来红领金服，最后才能进行单细胞测序上机分析。”连姗姗一边说，一边指了指实验台上大量坑洼的小洞，“这都是我们前期实验留下的痕迹。这一过程听起来不算复杂，实则非常考验实验者的实验流畅度，必须在最短时间内完成上述操作，以确保细胞的活性。其中任何一步出现问题，都要从头再来。”
功夫不负有心人。借助单细胞测序技术，团队发现，与高等脊椎动物骨髓中造血干细胞或前体细胞极低比例（通常<10%）相比，贝壳内的造血干细胞比例高达40%-60%。同时，贝壳内的细胞群体构成了一个造血干细胞巢，其组学特征、遗传调控机制、干细胞微环境、发育起源和分化、生物学功能等多个维度均支持与高等脊椎动物造血谱系具有同源性，打破了脊椎动物骨骼造血系统为“高等演化”的传统认知。
随后，团队又借助侏儒蛤这一壳薄、生长速度极快的小型贝类对贝壳干细胞的功能进行了验证。研究人员在其贝壳中央，远离外套膜的区域进行人为钻孔，“按照传统理论，这个位置的外套膜鞭长莫及，修复应该很慢甚至无法完成。
结果令人惊讶：9天后有机质层开始愈合，2至3周后出现矿化沉积——这直接证明了壳内细胞能驱动贝壳修复。”连姗姗介绍，随后，团队又通过反复抽血实验和原位杂交手段观察得出，干细胞标志物的表达呈现梯度分布——离壳近的地方多，离壳远的地方少。“发现贝类造血干细胞同时具有生物矿化功能，不仅挑战了外套膜作为唯一贝壳矿化组织的传统认知，同时也揭示了造血与矿化在动物祖先的深层次演化联系。”
“为了能够更充分地证明我们的研究成果，在原有实验基础上，我们还做了许多努力。在前期原位杂交标记迁移基础上，我们借助荧光染料对染色细胞进行了分选，发现这些分选出来的细胞在体外能够增殖。我们还加入了一些诱导分化的因子，观察到它们有向血细胞分化的趋势。这均证明我们分选到的细胞具有高等哺乳动物造血干细胞的两大核心特征：自我更新和分化潜能。”连姗姗介绍。此外，研究团队还发现，甲壳动物、棘皮动物和硬骨鱼等其他动物类群的矿化骨骼中也存在类似造血干细胞巢，并揭示出动物祖先造血干细胞核心调控基因集，提出“骨骼干细胞巢的重大演化创新为寒武纪动物大爆发的重要驱动力”的新理论学说。经过8年多的不断补充和完善，该团队的研究成果才得以正式刊出。
据悉，“无脊椎动物骨骼内普遍存在造血干细胞巢”的原创性发现，为迄今国际上首次发现存在跨动物界保守的普适性干细胞巢，是生命科学领域的重要进展，颠覆了骨骼造血为脊椎动物特有演化创新的传统观念，解答了长期困扰学术界的无脊椎动物造血干细胞来源之谜。该项原创发现不仅为理解动物造血系统起源演化提供了全新视角，也为海洋生物干细胞研究开辟了新领域和新方向。
目前，该团队已启动“DeepShell”项目，该项目将研究目标从最初9个物种扩展到近50个，涵盖整个动物界的主要动物骨骼类群和完整进化链条。“我们想以更为宏观的研究视角确认这一发现的普遍性，更想探索无脊椎动物类群骨骼干细胞高丰度的维持机制。”王师表示，这些机制可为人类再生医学领域干细胞研究或治疗策略研发提供重要启示。
信息来源：青岛日报社/观海新闻。
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